Le « syndrome métabolique » est un terme utilisé pour décrire une constellation de perturbations métaboliques (diabète, hypertension, dyslipidémies, obésité) qui prédisposent fortement au développement des maladies cardio-vasculaires telles que l’athérosclérose, une pathologie inflammatoire chronique de la paroi vasculaire [1]. Cette dernière se manifestant notamment par une infiltration des monocytes circulants dans l’intima de la paroi vasculaire, suivi de leur différenciation en macrophages (M) et leur transformation en cellules spumeuses, suite à une accumulation de dérivés estérifiés du cholestérol dans le cytoplasme. Des nombreuses études ont prouvé au niveau cellulaire et moléculaire que l’obésité est une pathologie inflammatoire chronique. La démonstration que les sujets obèses, et plus particulièrement ceux atteints du syndrome métabolique, ont des taux élevés de molécules inflammatoires telles que la CRP (C reactive protein) suggère que l’inflammation pourrait être un médiateur de la relation entre obésité/syndrome métabolique et développement de l’athérosclérose [2]. Le tissu adipeux (TA) qui est un organe de stockage des graisses est aujourd’hui considéré comme un véritable organe endocrine dont les anomalies de fonctionnement sont impliquées dans la physiopathologie de l’obésité, de ses complications cardio-vasculaires et métaboliques [3]. Le TA est constitué de deux fractions cellulaires, une fraction adipocytaire et une fraction stromale vasculaire (FSV) composée de préadipocytes, de vaisseaux sanguins (cellules endotheliales…), fibroblastes, de cellules souches, de cellules dendritiques, lymphocytes, et de M (dont le nombre augmente au cours de l’obésité). Chez les obèses (homme et souris), il existe une corrélation entre le nombre de M de la FSV, l’indice de masse corporelle, la taille des adipocytes et la masse grasse corporelle totale [4], [5]. De plus, en fonction de la localisation (viscérale ou sous-cutané) du TA analysé, des différences existent en terme de distribution du nombre de M, ce qui supporte un rôle potentiel des M dans le syndrome métabolique associé par exemple à l’obésité viscérale [6]. Des études comparatives ont démontré que la majorité des adipocytokines du TA, à l’exception de l’adiponectine et de la leptine, sont secrétées par des M. En effet, plusieurs de ces adipocytokines comme le TNFα, l’IL6, la résistine et l’adiponectine ont des effets sur la sensibilité à l’insuline [5]. L’adiponectine améliore la sensibilité à l’insuline, alors que la résistine, l’IL6 et le TNFα favoriseraient l’insulino-résistance [7]. Le rôle émergeant des M dans l’obésité et l’insulino-résistance renforce l’hypothèse selon laquelle l’inflammation chronique est strictement liée au développement de cette pathologie. Les M résidents dans le TA ne constituent pas une population homogène car il a été démontré qu’ils présentent un phénotype intermédiaire entre un état de polarisation M1 (pro-inflammatoire) et un état M2 (anti-inflammatoire) [8]. D’autre part, au cours du développement de l’obésité, il a été montré chez les souris que le nombre de macrophages M2 du TA diminue au profit des M1 [9]. La communication paracrine entre M et adipocytes serait à l’origine d’un cercle vicieux qui aggraverait l’état inflammatoire du TA. Les M colocalisent avec les adipocytes morts, ils absorbent les gouttelettes lipidiques libérées après nécrose des adipocytes et forment alors des cellules plurinuclées géantes marqueurs d’un stade inflammatoire avancé [10]. De plus, les adipocytes matures sécrètent des facteurs qui augmentent la diapédèse des monocytes circulants à travers la barrière des cellules endothéliales, facilitant ainsi l’infiltration des M dans le TA. En particulier, le monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) sécrété par les adipocytes est parmi les principaux responsables du recrutement des M au sein du TA [11], [12]. C’est ainsi qu’un phénomène physiologique d’épuration se transforme en un processus pathologique local puis général car l’ensemble de ces données suggère que les M infiltrés dans le TA peuvent enfin, par des effets systémiques, contribuer au développement des pathologies associées à l’obésité [13].

Il est désormais admis que certains récepteurs nucléaires (RN) peuvent exercer des actions anti-inflammatoires locales au niveau des M d’origine vasculaire. Parmi les RN avec un impact potentiel dans le contrôle de l’inflammation vasculaire, on peut citer les Liver X Receptors (LXR) qui existent en deux isoformes α et β, qui peuvent être activés par des agonistes synthétiques (T0901317, GW3965) ou naturels (les oxysterols). Des études menées en partie au sein de notre laboratoire montrent que ces RN régulent l’expression de certaines marqueurs inflammatoires des M, tels que la MMP-9, l’IL-6, le VEGF et le facteur tissulaire et qu’ils contrôlent l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme lipidique et glucidique, facilitant la lipogènese au niveau du TA [14]. De plus, il a été montré que les agonistes des LXR améliorent la tolérance au glucose dans un modèle expérimentale murin d’obésité et insulino-résistance induites par un régime alimentaire [14], [15]. Cependant, rien n’est connu à ce jour concernant l’expression et le rôle des LXR dans les M du TA (MTA), d’où le but de ce projet de thèse.

Les connaissances actuelles de la patho-physiologie de l’athérosclérose suggèrent un rôle central de la réponse inflammatoire dans le développement, la progression et les complications de cette pathologie. Des études récentes ont prouvé au niveau cellulaire et moléculaire que l’obésité est une pathologie inflammatoire chronique. Le M qui est une cellule à fort potentiel inflammatoire qui infiltre les lésions d’athérosclérose ainsi que le TA pourrait constituer le point de jonction entre l’obésité et l’athérosclérose. Compte tenu de l’impact de l’activation des RN dans le contrôle de la réaction inflammatoire vasculaire, nous nous sommes proposé d’étudier leurs fonctions dans les MTA. Les RN LXR apparaissent comme étant une cible thérapeutique de grand intérêt du fait de leurs propriétés anti-inflammatoires, raison pour laquelle nous avons choisis d’étudier leurs rôles dans les MTA. Un modèle de culture in vitro des M isolés à partir du TA humain (provenant des patients obèses ayant consentit de participer à cette étude, hospitalisés pour le traitement chirurgical d’une obésité sévère au sein du Service de Chirugie Générale et endocrinienne du CHRU de Lille dirigé par le Pr. François Pattou) avait été développé. Pour se faire, les MTA ont été purifiés à l’aide de microbilles immuno-magnétiques couplées à des anticorps pour les marqueurs spécifiques tel que CD14 (pour les M). La fraction cellulaire CD14+ qui correspondait aux MTA, avait été récoltée et remise en culture en présence d’un milieu adapté pour les expériences de pharmacologie. Le profil d’expression de LXR dans les MTA issus de localisations différentes (viscérale et sous cutané) avait été réalisé et nos résultats démontrent que LXRα et LXRβ sont bien exprimés dans les MTA, sans qu’une grande variation soit observée en fonction de l’origine du dépôt graisseux. La fonctionnalité des LXR au sein des MTA a été vérifiée ; pour se faire l’expression de leurs gènes cibles a été étudiée par Q-PCR et nos résultats montrent que les LXR des MTA répondent bien à l’activation par leurs ligands, comme le démontre une forte induction des gènes du métabolisme lipidique tels que ABCA1, SREBP-1c et FAS et l’inhibition de l’expression d’un certains nombre de cytokines et molécules pro-inflammatoires telles que TNFα, MCP-1 et MMP9.

Les principaux objectifs de notre projet ont été :

• • Etudier le rôle de LXR dans les fonctions des MTA

a) Identifier des nouveaux gènes cibles de LXR
b) Etudier les fonctions spécifiques des gènes cibles identifiés

• • Etudier la capacité de LXR à moduler l’état de polarisation M1/M2 des MTA
  • Etudier d’un point de vue fonctionnel le cross-talk entre MTA et adipocytes et sa régulation par les ligands de LXR.

• • • Etude du rôle de LXR dans les fonctions du MTA
      a) Identification de nouveaux gènes cibles
      Dans le but de comparer les MTA et les MDM (Macrophages Dérivants des Monocytes) et de mieux définir le rôle des LXR dans les MTA, nous avons utilisé une approche à large échelle du type « génome entier » grâce à la technologie du DNA-microarray Affymetrix dont nous disposons au sein de notre département. L’objectif principal étant d’identifier des nouveaux gènes cibles régulés par LXR de façon sélective au niveau des MTA c’est-à-dire de démontrer qu’une réponse pharmacologique spécifique aux ligands d’LXR existe entre ces 2 types de M. Pour se faire, les profils d’expressions géniques ont été réalisés sur les ARN isolés à partir des MTA et des MDM (différenciés in vitro en M à partir des monocytes circulants provenant du sang) issus du même patient obèse et traités ou non par les agonistes LXR (T0901317 1µM et GW3965 1µM) pendant 24 heures. Une analyse bio-informatique a été réalisée et les résultats obtenus (dont quelques uns ont été validés par Q-PCR) démontrent que lorsque l’on compare au niveau basale l’expression des gènes dans les MTA et les MDM, des voies de signalisation, en particulier celles des MAPK, p53, TGF-β, les jonctions serrées et adhérentes, apparaissent sur-exprimées dans les MTA. De plus, hormis le fait que de nouveaux gènes cibles potentiels de LXR ont été identifiés, fait intéressant, nous démontrons l’existence de gènes sélectivement régulés par les deux agonistes LXRs dans les MTA comparés aux MDM, et vice versa. Nous espérons que la comparaison des résultats obtenus dans les MTA et les MDM permettra de rapprocher les deux contextes que sont l’obésité et l’athérosclérose.
      b) Etude des fonctions des gènes cibles identifiés
      Les résultats obtenus nous ont déjà fournis des pistes intéressantes de réflexion mais les gènes cibles d’intérêts identifiés comme étant différentiellement régulés par les agonistes de LXR n’ont pas encore pu être étudiés d’un point de vue fonctionnel à l’aide par exemple des techniques de biochimie, car ces résultats proviennent d’un seul donneur. Actuellement, la même expérience que précédemment est entrain d’être répétée chez 4 autres patients obèses en utilisant les mêmes conditions expérimentales afin d’obtenir un nombre d’échantillon suffisant pour pouvoir faire une analyse statistique dans le but de confirmer nos résultats préliminaires et de passer à l’étape fonctionnelle de la voie (ou des voies) de signalisation(s) que nous auront sélectionnées comme étant la (ou les) plus intéressante(s). Nous espérons pouvoir utiliser des approches de type siRNA (développés au laboratoire) afin de diminuer l’expression d’un gène et d’évaluer ainsi sa contribution dans les effets de l’activation de LXR.
    • Etude de la régulation de la polarisation M1/M2 des MTA
      Il a été montré que les M en général présentent un état de polarisation hétérogène avec au sein du TA une prévalence du phénotype M1 (pro-inflammatoire) et une diminution du phénotype M2 (anti-inflammatoire). En ce qui concerne les MTA, la régulation de cette balance entre M1/M2 apparaissant actuellement comme étant un moyen potentiel pour contrôler l’état inflammatoire du TA, nous nous sommes intéressés aux effets in vitro des agonistes LXR sur la régulation de cette balance. Pour cela les MTA et les MDM des patients obèses et minces ont été traitées ou non par l’agoniste LXR le T0901317 pendant 24 heures en absence ou en présence d’IL-4 (15ng/ml), un fort stimulateur du phénotype M2. L’expression des marqueurs M2 (Récepteur au Mannose (MR), AMAC-1, CD163, IL-1Ra, IL-10…) a été mesuré par Q-PCR. Nos résultats montrent que l’activation des LXR par leur ligands ne semble pas réguler l’expression des marqueurs M2 dans les MTA de même que dans les MDM. Néanmoins, il est à noter que dans ces conditions, un léger effet est observé dans le cas d’AMAC-1 et de l’IL1-Ra. En outre, l’expression des marqueurs M2 dans les MTA ne semble pas corréler avec l’Indice de Masse Corporelle, le sexe et/ou l’âge des donneurs.
    • Etude fonctionnelle du cross-talk entre MTA et adipocytes et sa modulation par LXR
      Le cross-talk entre M et adipocytes étant une composante très importante du syndrome métabolique, il nous apparaissait indispensable de mettre en évidence l’interrelation entre M et adipocytes (dans la mesure du possible du même donneur) ceci par des approches in vitro, car il a été montré que les MTA pouvaient de façon indirect contribuer au développement des pathologies telle que l’insulino-résistance et diabète en favorisant l’hyperplasie des adipocytes dû à un empêchement de l’adipogenèse car les MTA inhibent la différentiation des pré-adipocytes en adipocytes en réponse à une suralimentation [16]. C’est pourquoi le rôle des LXR dans la modulation du cross-talk entre les MTA et adipocytes a été étudié dans le but de nous permettre d’évaluer l’impact des facteurs sécrétés par les MTA sur le métabolisme des adipocytes et de définir la modulation pharmacologique de cette connexion par LXR. Nous avons commencé par mettre au point un modèle in vitro d’adipocytes primaires humains issus de la différentiation des préadipocytes. Pour cela, les MTA et les préadipocytes du même donneur, ont été isolés, par la suite les adipocytes primaires ont été mis en contact avec le milieu de culture conditionné par les MTA après un traitement avec l’agoniste LXR T0901317, pendant 24h ; les ARN des adipocytes ont été récupérés. L’analyse de l’expression des gènes impliqués dans l’adipogenèse, la signalisation de l’insuline ainsi que dans l’inflammation a été réalisé par Q-PCR. Les résultats de cette co-culture indirecte entre les MTA et les adipocytes montrent que LXR joue un rôle dans la modulation du cross-talk entre les M et adipocytes en restaurant partiellement l’expression adipocytaire des gènes impliqués dans la lipogenèse, tel que PPARγ, LPL, … dans le métabolisme du glucose (Glut4) et de l’insuline (IRS1). Une diminution de l’expression des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire tel que MCP-1, TNFα… est observée. Les étapes suivantes de notre démarche scientifique seront d’étudier l’expression des gènes adipocytaires après induction d’une inflammation avec des cytokines inflammatoires tel que le TNFα suivi d’un traitement avec du milieu conditionné par des MTA traités ou non avec les agonistes LXR. L’impact sur la lipolyse, la captation de glucose, la phosphoryaltion des protéines appartenant à la voie de signalisation de l’insuline tel que Akt, ou la protéine S6 ribosomale, seront étudiés.

Le but de cette étude, à l’interface entre recherche clinique et recherche fondamentale, est d’apporter une meilleure compréhension de l’action des LXR des MTA. Nous croyons que la relation entre le syndrome métabolique associée à l’obésité et le risque de développement de l’athérosclérose est plus complexe que l’on croyait initialement. C’est pour cette raison que l’étude des actions des LXR au niveau des MTA apparaît comme étant d’un intérêt thérapeutique potentiellement très élevé car les accidents ischémiques se développent lentement et leur évolution restant parfois asymptomatique pendant plusieurs décennies. Les conséquences de ces accidents, quand ils ne sont pas mortels, entraînent souvent une altération de la qualité de la vie. La prévention de ces accidents par une meilleure compréhension des mécanismes responsables de l’apparition et du développement des lésions artérielles ainsi que le développement des nouveaux outils thérapeutiques, apparaissent donc comme une démarche de Santé Publique d’une très grande importance. Nous espérons donc que notre projet pourra apporter des informations essentielles pour l’évaluation de thérapeutiques agissant spécifiquement sur le TA et ses composantes dans le traitement des maladies cardio-vasculaires et le contrôle des états inflammatoires.

[1] Grundy SM. Metabolic syndrome : connecting and reconciling cardiovascular and diabetes worlds. J Am Coll Cardiol. 2006 ;47:1093-100.
[2] Guven A, Cetinkaya A, Aral M, Sokmen G, Buyukbese MA, Koksal N. High-sensitivity C-reactive protein in patients with metabolic syndrome. Angiology. 2006 ;57:295-302.
[3] Drevon CA. Fatty acids and expression of adipokines. Bioch. Biophys. Acta. 2005 ;1740:287-292.
[4] Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW, Jr. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest. 2003 ;112:1796-808.
[5] Xu H, Barnes GT, Yang Q, Tan G, Yang D, Chou CJ, Sole J, Nichols A, Ross JS, Tartaglia LA, Chen H. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. J Clin Invest. 2003 ;112:1821-1830.
[6] Bouloumie A, Curat CA, Sengenes C, Lolmede K, Miranville A, Busse R. Role of macrophage tissue infiltration in metabolic diseases. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2005 ;8:347-54.
[7] Hotamisligil GS, Arner P, Caro JF, Atkinson RL, Spiegelman BM. Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-alpha in human obesity and insulin resistance. J Clin Invest. 1995 ;95:2409-15.
[8] Zeyda M, Farmer D, Todoric J, Aszmann O, Speiser M, Gyori G, Zlabinger G, Stulnig T. Human adipose tissue macrophages are of an anti-inflammatory phenotype but capable of excessive pro-inflammatory mediator production. Int J Obes (Lond). 2007 ;31:1420-1428.
[9] Lumeng C, Bodzin J, Saltiel A. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 2007 ;117:175-184.
[10] Cinti S, Mitchell G, Barbatelli G, Murano I, Ceresi E, Faloia E, Wang S, Fortier M, Greenberg AS, Obin MS. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. J Lipid Res. 2005 ;46:2347-55.
[11] Kanda H, Tateya S, Tamori Y, Kotani K, Hiasa K, Kitazawa R, Kitazawa S, Miyachi H, Maeda S, Egashira K, Kasuga M. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. J Clin Invest. 2006 ;116:1494-505.
[12] Kamei N, Tobe K, Suzuki R, Ohsugi M, Watanabe T, Kubota N, Ohtsuka-Kowatari N, Kumagai K, Sakamoto K, Kobayashi M, Yamauchi T, Ueki K, Oishi Y, Nishimura S, Manabe I, Hashimoto H, Ohnishi Y, Ogata H, Tokuyama K, Tsunoda M, Ide T, Murakami K, Nagai R, Kadowaki T. Overexpression of monocyte chemoattractant protein-1 in adipose tissues causes macrophage recruitment and insulin resistance. J Biol Chem. 2006 ;281:26602-14.
[13] Ross R. Atherosclerosis – An inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 1999 ;340:115-126.
[14] Laffitte BA, Chao LC, Li J, Walczak R, Hummasti S, Joseph SB, Castrillo A, Wilpitz DC, Mangelsdorf DJ, Collins JL, Saez E, Tontonoz P. Activation of liver X receptor improves glucose tolerance through coordinate regulation of glucose metabolism in liver and adipose tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 ;100:5419-24.
[15] Kalaany NY, Gauthier KC, Zavacki AM, Mammen PP, Kitazume T, Peterson JA, Horton JD, Garry DJ, Bianco AC, Mangelsdorf DJ. LXRs regulate the balance between fat storage and oxidation. Cell Metab. 2005 ;1:231-44.
[16] Maumus M, Sengenès C, Decaunes P, Zakaroff-Girard A, Bourlier V, Lafontan M, Galitzky J, Bouloumié A. Evidence of in situ proliferation of adult adipose tissue-derived progenitor cells : influence of fat mass microenvironment and growth. J Clin Endocrinol Metab. 2008 ;93(10):4098-106.